FLA-2000を用いてVistra ECFのシグナルを検出し、
その結果をMacBASで定量する方法

実験室で行う操作

1. アルカリフォスファターゼが結合した抗体を反応させる。
2. 0.05〜0.1%(w/v)のTween20またはTriton X-100を含むバッファー（pH 7.4ぐらい）中でメンブレンを振盪する。（5分間×3回）
3. 界面活性剤を含まないバッファー中でメンブレンを振盪する。（5分間×2回）
4. 上記の操作中に、実験台を水で軽く濡らし（霧吹きをかけた程度）、約30cmほどの長さのサランラップをしわになったり空気が入らないようにぴちーっと実験台上に広げる。
5. "Detection Reagent"（約1mL/メンブレン50cm²）を広げたラップ上に滴下する。
   • Vistra ECF Western blotting kit （code#:RPN5780; Amersham Pharmacia Biotech）
   • 定価 \68,000 (60mL)
   • 発売元による詳しい情報（およびプロトコール）は、次のURLを参照。
     http://www.apbiotech.com/technical/documentation/dna_protein/rpn5780.html
   • この試薬に含まれる蛍光基質（AttoPhos）については、次のURL（およびそこでリンクされているページ）を参照。（Takaraも同等の製品を販売している。）
     http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C1042
6. メンブレンからバッファーをよく切って（ただし乾燥させない）、転写面が下になるように（reagentに直接触れるように）して置く。その後、いったんメンブレンを持ち上げ、泡が入らないように注意して再び広げる。
7. 室温で5〜15分間静置する。（シグナルが強ければ、その部分が黄色になる。──蛍光灯の光によって励起された蛍光が見える）
8. 広げたサランラップのreagentで濡れていない部分を使って、メンブレンからreagentを落とす（ただし乾燥させない）。
9. FLA-2000の検出板（FLUORステージ）上に、転写面が下になるように（透明なステージに直接触れるように）して置く。

FLA-2000およびMac上で行う操作

1. FLA-2000の電源を入れ、約5分以上経ってからMacを起動する。
2. FLA-2000を操作するソフト「Image Reader」を立ち上げる。
   （レーザーのキャリブレーションを30日間行わないと自動的に「実行したいんだけど...」と言ってくるので、そのときはキャリブレーションを行う。）
3. メインウィンドウ上で次のことを順番にチェックする。
   • Sample Mode: 「Fluor.473nm:O580」または「Fluor.473nm:O520」
     （これを変更するのには、数分間かかる。後者の方がシグナルは強いがバックも高い。）
   • Sample Area: Free
   • Gradation: 65536 (16bit)
   • Resolution: 50　　（画素サイズ: 50μm）
   • Sensitivity: 「F10」ぐらいで大丈夫だと思う。
     （F1が最も感度が低く、F10はF1の10倍の感度、…、F1000はF1の1000倍の感度）
   • 「File size: xxx MB」の下にある選択肢: Read & Launch MacBAS
4. メンブレンを乗せたFLUORステージをFLA-2000に（きちんと）セットする。ステージの裏面が濡れていると故障の原因になるので、水滴があれば拭きとっておく。
5. FLA-2000のふたをきちんと閉める。
6. Image Readerのメインウィンドウ上で、読み取る範囲を（マウスで）ドラッグして選択し、「Read」ボタンをクリックする。
   
   
7. 読みとりが終了すると、自動的に「MacBAS」という解析ソフトが起動する。
8. Trimmingウィンドウ上で、画像を適宜トリミングし、その後、回転・反転させる。
   （これ以降の操作では画像を回転・反転することができないので、ここで適切な方向および面にしておくことが重要。）
9. 適宜、「Range Scope」をいじって、見栄えをよくする。
   （この操作をしても、シグナル強度の数値は変わらない。見た目が変わるだけ。）
10. 「OK」をクリックする。と、MacBASのメインウィンドウが開く。
11. いったん、ファイルをセーブしておく。こまめにファイルを保存するクセを付けておこう。
12. さらなる"見た目"を追求したかったら、メニューバーから[Image]-[Brightness/Contrast]を選択してみる。
    
    
13. メインウィンドウの左上の方にある「Mode▼」から「Quant」を選択し、定量モードにする。
14. メニューバーから[Windows]-[Quant Result]を選択し、定量結果を表示させるためのウィンドウを開く。
15. QuantResultウィンドウの右上の方にある「ｫ」をクリックし、（少なくとも）次の項目を表示するようにする。
    「Group」,「LAU」,「Area」,「LAU-BG」,「Information」
16. Quantモード用のツールボックスから、適宜ツールを選択して定量したい領域（シグナル）を設定する。
    （左から、矢印、四角形、フリーハンド、多角形ツール…。たぶんこれ以外は使わないだろう。）
17. バックグラウンドを計測する領域を設定する。ツールを矢印にして、「z」キーを押してから（押しながら）、16.で選択した領域をバックグラウンドとして適切な位置までドラッグする。（こうすれば、同じ面積の領域をコピーすることができる。）
    通常、シグナル（ポジティブなバンド）のすぐ上、あるいは、すぐ下の領域をバックグラウンドとする。すぐ上とすぐ下の両方（の平均値）をバックグラウンドとすることもできる。その場合は、18.でその両方をバックグラウンドに設定し、19.で「シグナル」と「すぐ上」と「すぐ下」の3者を同一のグループにすれば、自動的にすぐ上とすぐ下の平均値をバックグラウンドとして計算してくれる（はず）。
18. QuantResultウィンドウで、バックグラウンドに相当するサンプルの「Info」ボックスの左半分エリアをダブルクリックする。すると、「B」マークが表示される。
19. ペアになっているシグナル領域とバックグラウンド領域について、両方の「No.」ボックスをシフトキーを押しながら選択する。その後、「z」＋「G」を押して、グルーピングする。
    
    
20. QuantResultウィンドウをプリントアウトするときは、このウィンドウをアクティブにしてから、[File]-[Print...]を選択する。印刷方法を尋ねてくるが、「Normal...」を選ぶ。
21. Macの電源を落としてから、FLA-2000の電源を切る。
22. FLUORステージは、やわらかいスポンジあるいは素手でよく水洗いする。

注： ここでは、「LAU」のかわりに「AU」と表示されている。

「LAU（AU）」が、各画素のシグナル強度を（選択した領域にわたって）積算した値を示している。